Gram

Farbenie gramov je užitočné na vizualizáciu rôznych typov baktérií

Čo je Gramovo zafarbenie?

Ten Gram Je to najjednoduchšia a najužitočnejšia sfarbenie v diagnostickej mikrobiológii na identifikáciu baktérií. Túto techniku ​​vytvorila dánsky doktor Christian Gram v roku 1884, ktorý klasifikoval baktérie do gram -pozitívnych (fialových) a gram -negatívnych (ružových), podľa zloženia bunkovej steny.

Táto technika utrpela určité úpravy Huckerom v roku 1921 na stabilizáciu reagencií a zlepšenie kvality farbenia, takže Gramovo farbenie je známe aj ako gram-hucker.

S touto technikou je tiež možné. Rovnako ako jeho distribúcia vo vesmíre: v klastri, v reťazci, izolovaný, v pároch, v tetradoch atď.

Základ

Je to technika, ktorá predstavuje 4 základné kroky: zafarbenie, fixovanie s mordantom, sfarbenie a prijímanie do zamestnania. Preto, okrem sfarbenia baktérií, vám tiež umožňuje rozlíšiť ich.

Fialové kryštály je použité prvé farbivo. To isté má afinitu k peptidoglykánu a farbije všetky prítomné baktérie, následne umiestnili Lugol, ktorý pôsobí ako mordant, to znamená, že vo vnútri bunky vyvoláva tvorbu nerozpustných komplexov fialového skla/jód/ribonukleárnych proteínov.

Gramovo pozitívne baktérie, ktoré majú hustú peptidoglykánovú stenu, tvoria zložitejšie (fialové/jódové sklo), preto budú zafarbené fialové.

Ovplyvňuje tiež, že stena grampozitívnych baktérií obsahuje viac nekonečných kyselín, ktoré vykazujú veľkú afinitu k oxidačným činidlám (Lugol).

Gram -negatívne baktérie majú tenký mys peptidoglykánu, vďaka čomu sú baktérie menej zložité ako gramovo pozitívne.

Následne prichádza krok sfarbenia, kde sa gram -pozitívne a gramnegatívne baktérie správajú inak.

Gram -negatívne baktérie obsahujú vonkajšiu membránu bohatú na lipopolysacharidy, ktoré sú súčasťou jej bunkovej steny. Tuky sú zničené kontaktom s acetónovým alkoholom, takže vonkajšia membrána je destabilizovaná, fialové sklo sa uvoľňuje.

Takto sa neskôr najíma so základným safranínom alebo fuchsinom, ktorý berie červenú farbu.

V prípade gram -pozitívnych baktérií odolávajú sfarbeniu, pretože bielidlo pôsobí zatvorením pórov, čo bráni fialovému kryštálovému komplexu/jódu, aby sa mohli dostať von.

Preto je sfarbenie s fialovým sklom stabilné a nie je miesto pre safranín alebo fuchsin. Preto sú tieto baktérie zafarbené intenzívne alebo fialové.

Materiál

Gramova farebná súprava sa skladá z:

- Fialové sklo.

- Lugol.

- Acetón.

- Základný safranín alebo fuchsin.

Príprava farbív a reagencií

Fialový kryštálový roztok

Riešenie pre:

Fialový krištáľ - 2 gr

95% - 20 cm3 etylalkohol

Riešenie B:

Amónny oxalát - 0.8 gr

Destilovaná voda- 80 cm3

Na konečnú prípravu fialového skla musí byť roztok na 1:10 zriedený destilovanou vodou a zmiešajte so 4 časťami roztoku B. Zmes sa pred použitím uchováva 24 hodín. Filtruje sa do fľaše na farbenie jantáru pomocou papierového filtra.

Môže vám slúžiť: Chiapas Flora a Fauna: Reprezentatívne druhy

Množstvo použité denne sa presunie na jantárovú fľašu s kvapkadlom.

Jód-lugol

Zvážte a zmerajte uvedené množstvo každej zlúčeniny takto:

Jódové kryštály - 1 gr

Joduro draselný - 2 gr

Destilovaná voda - 300 cm3

Jodid draselného sa rozpustí o málo vo vode a následne sa pridá jód. Roztok fľaše jantáru sa prenáša.

Použité množstvo denne sa presunie na menšiu jantárovú fľašu s kvapkadlom.

Diskonzory

95% etylalkohol - 50 ml

Acetón - 50 ml

Je pripravený v rovnakých častiach. Dobre prikryte, pretože má tendenciu sa odparovať.

Bottero v fut.

Tento prípravok poskytuje mierny čas sfarbenia 5-10 sekúnd., A je to najviac odporúčané.

Začiatočníci uprednostňujú používanie iba 95%etylalkoholu, kde je sfarbenie pomalšie, od 10 do 30 sekúnd.

Zatiaľ čo najskúsenejší môžu použiť čistý acetón, kde sa sfarbenie vyskytuje veľmi rýchlo od 1 do 5 sekúnd.

Kontrast

SAFRANINE Matka Riešenie

Safranine - 2.5 gr

95%etylalkohol - 100 cm3

Po zvážení uvedeného množstva safranínu sa rozpúšťa pri 100 cm3 etylalkoholu na 95%.

Z materského roztoku sa pripravuje pracovný roztok Safranine.

Aby ste to dosiahli, zmerajte 10 cm3 materského roztoku, pridajte 90 cm3 destilovanej vody na dokončenie 100 ml.

Odporúča sa prenášať množstvo používaného denne na jantárovú fľašu s odkvapkávačom.

Mikroorganizmy, ktoré sú slabo zafarbené gram-huckerovým farbením, ako určité anaeróby, Legionella SP, Campylobacter SP a Brucella SP, Môžu byť zafarbené oveľa lepšie, ak sa modifikácia uskutočnila na farbenie gram-huckeru, nazývaného farbenie gram-kopeloff.

Táto technika mení farbivo Safranine pre základný fuchsin. Pri tejto modifikácii je možné účinne zafarbiť vyššie uvedené mikroorganizmy.

Úložisko činidla

Pripravené farbivá sa musia skladovať pri izbovej teplote.

Príprava rozšírenej vzorky na sfarbenie

Vzorka musí obsahovať najmenej 10⁵ mikroorganizmy pred jeho pozorovaním sú pravdepodobne v nátere. Rozšírené môžu byť vykonané z priamej vzorky alebo plodín v pevných alebo tekutých médiách.

Rozšírené musia byť rovnomerné, dobre distribuované a nie príliš silné, pre lepšiu vizualizáciu prítomných štruktúr.

Gram priamych vzoriek

Gram moču bez odstreďovania

Moč je zmiešaný a 10 ul sa umiestni na posúvač. Pozorovanie aspoň jedného poľa baktérie/ponorenia naznačuje, že existuje infekcia.

To znamená, že plodina bude mať približne viac ako 100.000 ufc/ml (10⁵ UFC/ml) moču v 85% prípadov.

Táto metóda nie je užitočná pre koloniálne počty pod 100.000 UFC.

Gram CSF

CSF by sa mala odstrediť, supernatant je odstránený a sediment sa rozširuje v posúvaní. Táto tekutina je za normálnych podmienok sterilná. Pozorovanie baktérií naznačuje infekciu.

Môže vám slúžiť: soľné žľazy

Gram dýchacích vzoriek

Spúta gram, bronchiálne alebo bronkoalveolárne umývanie, aj keď môže existovať rôzne mikroorganizmy, vždy bude viesť diagnózu, okrem toho, že bude užitočným typom pozorovaných buniek.

V prípade ESPUTO sa musí pripraviť rozšírená časť s najurpovanejšou časťou vzorky.

Výkaly

Nie je vhodné robiť gram pre tento typ vzoriek, pretože nemá diagnostickú hodnotu.

Gram plodín

Môžu sa robiť dvoma spôsobmi, jeden z tekutých plodín a druhý z pevných plodín.

Tekuté plodiny

Z tekutých plodín je mimoriadne jednoduché: pod ľahšími sa niekoľko pečených škvŕn a umiestnených na čisté a suché posúvanie, čo dáva kruhové pohyby od stredu po obvod, aby sa materiál rovnomerne distribuoval.

Je povolené spontánne vysielať. Po vyschnutí je materiál pripevnený k plachte s ohrievaním. Ak to chcete urobiť, pomocou svorky prechádzate plachom 3 až 4 krát cez plameň Bunsen ľahšieho, opatrne nespáliť materiál.

List sa nechá ochladiť a umiestniť na sfarbenie mostu.

Plodiny

Ak chcete vykonať predĺžené gramové zafarbenie z pevnej plodiny, postupujte takto:

Pred výberom kolónií, ktoré sa majú vziať, musíte pripraviť jahňacie mäso a umiestniť približne dve kvapky sterilného fyziologického soľného roztoku.

Ak pôvodná kultivačná doska obsahuje niekoľko typov rôznych kolónií, na vykonanie gramu sa vyberie izolovaná kolónia každého z nich. Každá kolónia sa odoberie pomocou platinovej rukoväte, aby sa rozpustila v roztoku soľného roztoku, ktorý bol predtým umiestnený na posúvaní.

Kruhové pohyby sú uvedené od stredu po perifér.

Je povolené spontánne vysielať. Akonáhle je suchý, plachta je pripevnená teplom, ako je vysvetlené vyššie (plameň štrbinového slotu s zapaľovačom), pričom buďte opatrní, aby ste materiál nespálili.

Tento postup sa musí vykonávať s každým rôznym typom kolónie. Poradie toho, čo sa pozoruje, napríklad:

Kolónia 1: Betahemolytická žltá kolonia: Gramovo pozitívne kokosové orechy boli pozorované v klastroch.

Colonia 2: Krémová kolonia, bez hemolýzy: boli pozorované gramnegatívne kokobacily.

Každý list musí byť označený, aby vedel, čo pozorujeme.

Technika

Technika sfarbenia spoločnosti Gram je veľmi jednoduchá a relatívne ekonomická a v mikrobiologickom laboratóriu nemôže chýbať.

Robí sa to takto:

1. Položte náter s teplom a umiestnite na sfarbenie mostu.
2. List je úplne pokrytý fialovým sklom o 1 minútu.
3. Umyť vodou. Nescharte.
4. Zakryte hárok roztokom Lugol, nechajme 1 minútu. Umyť vodou. Nescharte.
5. Ozdobte 5-10 sekúnd s mäkkým agitáciou v acetónom alkoholu. O Vložte plachtu vertikálne a vyhodte odfarbenie kvapiek na povrch, až kým netiahne náhradu fialového kryštálu. Nepresahovať.
6. Umyť vodou. Nescharte.
7. Položte hárok na sfarbenie mostu a zakryte 30 sekúnd s Safranine (Gram-Hucker) alebo 1 minúta so základnou fuchsinou (gram-kopeloff).
8. Umyť vodou.
9. Spontánne vypustiť vo vzduchu vo vertikálnej polohe.

Môže vám slúžiť: Flora a fauna

Akonáhle je suchý, vložte 1 kvapku ponorného oleja, aby ste ho pozorovali pod cieľom 100x do optického mikroskopu.

Použitie/aplikácie gramového zafarbenia

- Táto technika umožňuje rozlíšiť morfotintoriálne rozdiely vo väčšine baktérií.

- Kvasinky sa tiež rozlišujú týmto sfarbením. Berú fialové sklo, to znamená, že sú zafarbené gram -pozitívne.

- Môžete rozlíšiť gramovo pozitívne spóry bacily, kde v bacile je pozorovaný číry priestor, kde sa vytvorila endospora, hoci spóry nie sú dobre zafarbené. Na farbenie spór sa používajú ďalšie techniky, napríklad Shaeffer-Fulton.

- Pomáha určiť typ antibiotika, ktorý sa musí pripraviť.

Je potrebné poznamenať, že toto zafarbenie To nefunguje Na zafarbenie všetkých typov baktérií, to znamená, existujú prípady, keď farbenie nefunguje.

V týchto prípadoch je možné spomenúť baktérie, ktoré nemajú bunkovú stenu. Napríklad: Pohlavie Mykoplazma, sféroplast, Močovina, L formy a protoplasty.

Okrem toho baktérie s baktériami bohaté na mykolové kyseliny, ako sú mykobaktérie a intracelulárne baktérie, ako sú chlamýdia a rickettsias.

Je tiež neúčinná farbenie väčšiny spirochemálnych baktérií.

Existujú baktérie toho istého rodu, ktoré sa dajú pozorovať v rovnakej vzorke ako gram -pozitívne a ako gram -negatívne. Ak sa to stane, nazýva sa to variabilné gramové farbenie, ktoré môže byť spôsobené zmenou živín, teploty, pH alebo koncentrácie elektrolytov.

Bežné chyby

Zdobiť

Preháňanie v sfarbení môže spôsobiť pozorovanie falošných gram -negatívnych mikroorganizmov.

Nečakajte na dostatok času na sušenie na pridanie ponorného oleja

Táto chyba spôsobuje vytvorenie tukových micelov, ktoré bránia pozorovaniu prítomných štruktúr. K tomu dochádza, keď sa olej spája s molekulami vody prítomný vo vôni.

Investovať poradie reagencií

Chyba, ako je táto.

Používajte staré plodiny (tuhé látky alebo tekutiny)

Môže spôsobiť, že gramovo pozitívne baktérie zafarbujú gram -negatívne (gram -negatívne false). Stáva sa to preto, že v starých plodinách je pravdepodobné, že sú mŕtve alebo zhoršené baktérie, a za týchto podmienok si baktérie nezachovávajú fialové sklo.

Použite veľmi staré roztok Lugol

V priebehu času Lugol stráca svoje vlastnosti a jej farba mizne. Ak sa použije už degenerované činidlo, neopraví to fialové sklo dobre, preto existuje možnosť získať vizualizáciu falošne gram -negatívnych mikroorganizmov.

Modré pozadie

Správne sfarbené pozadie bude červené. Modré pozadie naznačuje, že sfarbenie bolo nedostatočné.

Odkazy

1. Domy-rincón, g. (1994). Všeobecná mykológia. Venezuelská univerzita.
2. Gram. Z toho vzaté.Wikipedia.orgán.
3. González, m., González, n. (2011). Lekárska mikrobiologická príručka. Riaditeľstvo médií a publikácií na University of Carabobo.