Half Löwenstein-Jensen Foundation, príprava a použitie

On Stredný Löwenstein-Jensen Je to selektívne tuhé médium pre izoláciu a vývoj baktérií rodu Mycobacterium, ako je napríklad Tuberkulóza mycobacterium, M. Avium, okrem iného, ​​s výnimkou druhov Leprae, čo nie je kultivovateľné.

Baktérie rodu Mycobacterium nerastú v konvenčných kultivačných médiách, preto bolo potrebné navrhnúť špeciálny prostriedok pre jeho izoláciu. Pôvodné médium vytvoril Löwenstein a potom ho upravil Jensen.

Half Löwenstein-Jensen s kolóniami Mycobacterium tuberculosis. Zdroj: Agarwal a kol. / Biomed Central Ltd., S láskavým dovolením knižnice biológie obrazu

Modifikácia pozostávala z eliminácie červeného farbiva Konga, ktorá ju nahradila za väčšiu koncentráciu malachitovej zelenej farby. Tiež zmenil koncentrácie citrátu horečnatého a monopotázného fosfátu.

Médium Löwenstein-Lose v súčasnosti obsahuje papátový škrob, asparragín, magnetický citrát, fosfát monopo-fázy, magnetický sulfát, malachitovo zelená, kyselina nalidínom, kyselina cykloheximididimid.

Mycobacteria je zvyčajne izolovaná z miest, ktoré nie sú sterilné, napríklad spúta, moč, abscesy,. To znamená, že väčšina vzoriek bude obsahovať obvyklú mikrobiotu v oblasti plus patogén.

Preto médium Löwenstein-Jensen obsahuje sériu inhibítorov vo svojom zložení predstavovanej malachitovou zelenou, antibiotikami a antifungálmi.

Okrem toho musia byť vzorky, ktoré pochádzajú z nesterilného miesta.

[TOC]

Základ

Prítomnosť vajec a glycerínu v médiu Löwenstein-Jensen stimuluje rast mykobaktérií, pretože poskytujú mastné kyseliny a proteíny potrebné na vývoj týchto mikroorganizmov.

Médium Löwenstein-Jensen obsahuje malachitovú zeleň, ktorá je sprievodným inhibítorom mikrobioty. Ale obsahuje tiež kyselinu nalidíxickej (35 ug/ml), ktorá inhibuje gramne negatívne mikrobioty, cykloheximid (400 ug/ml), ktorý inhibuje huby a kvasinky s mikrobiotami (2 um/ml), ktorý inhibuje mikrobiota gram pozitívne.

Niektoré komerčné domy uprednostňujú pridanie nasledujúcej kombinácie antibiotík: Polymixina B 200.000 jednotiek/l, amfotericín B 10 mg/l, karbenicilín 50 mg/l a trimetoprima 10 mg/l.

Toto médium neobsahuje agar, preto sa tuznifikácia média vyskytuje koaguláciou albumínu prítomného vo vajci počas sterilizácie.

Príprava

Vážiť 37,3 g dehydratovaného média v 600 ml destilovanej vody, ktorá bola predtým pridaná 12 ml glycerolu. Zmes sa zahrieva, často mieša až do celkového rozpustenia. Autoclavar médium pri 121 ° C počas 15 minút.

Môže vám slúžiť: 12 stupňov ľudského rozvoja a jeho charakteristiky

Na druhej strane by sa v aseptických podmienkach mala pripraviť homogénna suspenzia 1000 ml čerstvých vajíčok. Pridajte suspenziu vajec pri 600 ml pripravených pri teplote 50 - 60 ° C, pričom sa vyhnite vzduchovým bublinám.

Roztoky antibiotík sa tiež pridávajú po sterilizácii v autokláve.

Nalejte médium do sterilných skúmaviek. Zahrejte trubice pri 85 ° C počas 45 minút v naklonenej polohe.

Farba pripraveného média je aguamarine zelená a môže prezentovať belavé body pre prítomnosť vaječných lipidov.

Médiové pH musí byť 7,2 ± 0,2

Uložte si chladničku a chránené pred priamym svetlom až do použitia. Potopiť sa pred siatom.

Existuje modifikácia média nazývaného „Gruft Modifikácia Löwenstein Jensen“. Obsahuje rovnaké zlúčeniny ako klasické médium, ale RNA-5mg/100 ml sa pridá a ako inhibítory obsahujú malachitovo zelené 0,025 g/100 ml, penicilín 50 U/ml a Nalidinexixico 35 Ug/ml kyselina kyselina.

Žiadosti

Médium Löwenstein-Jensen sa používa na izoláciu mycobacteria, z rôznych typov vzoriek. Odporúča sa vykonať farbenie Ziehl-Neelsen na akúkoľvek vzorku, v ktorej je podozrivá prítomnosť mykobaktérií.

Niektoré vzorky pochádzajú zo sterilných miest, ale iné nie. Vzorky, ktoré nie sú v prevádzke, musia byť dekontaminované tak, ako to môže byť:

Spúta

Vzorky spúta musia byť dekontaminované takto: Určite množstvo vzorky spúta v ML a pridajte k rovnakému množstvu 4% NaOH a incus do 37 ° C.

Zmes sa často potriasť po dobu 30 minút. Následne odstrediv pri 3 000 ot./min. Počas 30 minút.

Zlikvidujte supernatant na fenolovom dezinfekčnom roztoku. Použite siatie sedimentu, ale najskôr sa musí pH neutralizovať.

Na neutralizáciu sedimentu sa používa H₂SW₄ pri 5% v prítomnosti indikátora červeného fenolu, až kým nevedie k neutrálnemu pH, ktorý vzniká farbou lososa.

Umývanie žalúdka, bronchiálne umývanie a bronchiálny aspirát

V tomto prípade by sa vzorka mala centrifugovať pri 3 000 ot./min. Počas 30 minút. Supernatant je vyradený a používa sa sediment. Na dekontamináciu sedimentu sa pridá 3 ml 4% NaOH a často sa mieša pri 37 ° C po dobu pol hodiny.

Môže vám slúžiť: stróma (histológia)

Opäť odstredivka, supernatant je vyradený a používa sa sediment. Ten musí byť neutralizovaný, ako je vysvetlené vo vzorke spúta.

Moč

Nechajte vzorku v chladničke 24 hodín. Oddeliť supernatant. Zostávajúci sediment sa musí centrifugovať po dobu 30 minút pri 3000 RMP. Zbavte sa supernatantu a rekonštruujte sediment s 3 ml sterilného fyziologického roztoku.

Pridajte 3 ml 4% NaOH a pokračujte v dekontaminácii a neutralizácii, ako je opísané vyššie.

Ascitická tekutina, pleurálna tekutina, mozgovomiechový mriežka

V tomto type vzorky je odstredený a supernatant je vyradený. Vytvorte gram na sediment alebo pozorujte priamo v mikroskope; Ak sa baktérie nepozorujú, priechod dekontaminácie nie je potrebný a ani neutralizácia.

V tomto prípade môže byť vzorka priamo zasiate pomocou sedimentu. Ak existujú baktérie, pokračujte v dekontaminácii a neutralizácii, ako je opísané vyššie.

Biopsa

Tento typ vzorky by sa mal pridať 5 ml destilovanej vody do neskoršej centrifuge pri 1500 ot / min počas 10 minút. Zlikvidujte supernatant a odstredite sediment pri 3500 ot./min. Počas 30 minút. Použite sediment na zasievanie kultivačného média.

Hiophare hrtan

Vár sa musí zaviesť do sterilnej trubice obsahujúcej rovnaké časti destilovanej vody a 4% NaOH. Vár musí byť pritlačený na steny trubice, aby sa vzorka zriedila v kvapaline. Odstredivka a používajte sediment. Neutralizovať sediment, ako už bolo opísané.

Vysiať

Médium Löwenstein-Jensen je naočkované pridaním 0,5 ml vzorky na povrchu média. Otočte trubicu, aby ste rozložili vzorku v celom médiu. Nenoste platinovú rukoväť.

Môžete zasiať druhú trubicu obsahujúcu polovicu Stonebrink, aby ste izolovali Mycobacterium bovis a ďalšie druhy, ktoré nerastú v prostredí Löwenstein-Jensen.

Inkubácia

Naočkované trubice sa inkubujú pri aerobióze pri 37 ° C, s mierne lenivým vekom a naklonené približne 5 ° a chránené pred svetlom. Prostredie s oxidom uhličitým môže byť obohatené na 5-10%. Skontrolujte plodiny dvakrát týždenne, až kým sa objaví kolónie.

Môže vám slúžiť: nosový exsudát: Na čo ide, postup, kultivácia

Po absorpcii vzorky sú tapas nastavené. Maximálny čas inkubácie je 8 týždňov, ak po tomto čase nie je hlásený žiadny rast ako negatívny.

Qa

Ako kontrola kvality môžete použiť nasledujúce kmene:

Tuberkulóza mycobacterium ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium nanestartum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Pyogenes Streptococcus ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Pre prvé tri uvedené druhy sa očakáva vynikajúci vývoj M. Výstavba Rast musí byť dobrý, zatiaľ čo pre M. Bovis Očakáva sa nedostatok alebo nulové rast. Zatiaľ čo druhy iné ako rod Mycobacterium musia byť úplne inhibované.

Obmedzenia

Pripravené médium sa musí chrániť pred svetlom, predĺžené vystavenie svetlu robí strednú vire od zelenej po modrú, v tomto prípade sa médium už nedá použiť. Je to preto, že Malachite's Green je fotosentibilný.

Médium, pretože obsahuje vajíčko, sa dá ľahko kontaminovať, ak nie je asepticky manipulované. Môže sa rozpustiť, ak je kontaminovaný proteolytickými baktériami.

Kultivácia a manipulácia s baktériami rodu Mycobacterium vyžaduje kvalifikovaného personálu, ktorý si je vedomý opatrení biologickej bezpečnosti, ktoré sa musia splniť, aby sa predišlo kontaminovaniu alebo kontaminácii ostatných.

HCl by sa nemal používať pri prechode neutralizácie v dôsledku tvorby chloridu sodného, ​​ktorý môže byť toxický pre Koch Bacillus.

Vzorky sa musia udržiavať chladené a chránené pred svetlom, pokiaľ nie sú spracované.

Referencia

1. Laboratóriá Francisco Soria Melguizo. 2009. Löwenstein-Jensen Selektívne médium. K dispozícii na: F-Soria.je
2. Británske laboratóriá. 2017. Löwenstein-Jensen médium. Dostupné na: BritánAlab.com.
3. Neogen laboratórium. Löwenstein-Jensen médium. K dispozícii na: Potravinová bezpečnosť.Neogén.com.
4. „Stred Löwenstein-Jensen.„ Wikipedia, encyklopédia zadarmo. 20. novembra 2018, 15:15 UTC. 24. apríla 2019, 18:34. Wikipedia.orgán
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. PAN -AMERICKÁ REDICIAL S.Do. Argentína.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld a. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey a Scott. 12 ed. PAN -AMERICKÁ REDICIAL S.Do. Argentína.
7. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu baktérií klinického významu. 3. vydanie. PAN -AMERICAN. Buenos Aires. Argentína.