Imunofluorescenčná nadácia, protokol a aplikácie

Ten imunofluorescencia Je to silná imunomarcová technika, ktorá používa protilátky United United k fluorescenčným molekulám na identifikáciu špecifických cieľov vo vzorkách buniek fixovaných na pevnej podpore.

Táto technika mikroskopická pozorovanie s imunitnou špecifickosťou, čo umožňuje pozorovanie živých alebo mŕtvych buniek, ktoré môžu mať malé množstvá antigénov. Všeobecne sa používa v oblasti výskumu, ako aj v klinickej diagnostike rôznych patológií.

Imunomariness aktínových vlákien v kardiomyocytových bunkách (zdroj: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licencie/By-SA/4.0)] Via Wikimedia Commons)

Táto hlavne kvalitatívna technika (s niektorými kvantitatívnymi variantmi) musí robiť konkrétne s vizualizáciou vzorky produktom fluoroforu, ktorý je fluorescenčnou molekulou pripojenou k protilátke a ktorá je schopná vzrušovať sa pri určitej vlnovej dĺžke.

V bunkovom kontexte je veľmi užitočné študovať prítomnosť/neprítomnosť a subcelulárne umiestnenie proteínov. Táto technika sa použila pri jej začiatkoch v klinickej oblasti na diagnostiku vírusov, ako je chrípka a následne pre mnoho ďalších infekčných chorôb.

Je to technika veľkej citlivosti a so správnym tímom mikroskopie môže mať veľmi dobré rozlíšenie. Na svoje pozorovanie vyžaduje použitie konfokálnych alebo epifluorescenčných mikroskopov.

Napriek tomu, že ste veľmi populárni, môžete predstaviť niektoré dôležité problémy týkajúce sa získania nešpecifickej fluorescencie, ktorá vytvára v pozadí určitý „hluk“, čo často obmedzuje správne čítanie výsledkov.

[TOC]

Základ

Imunofluorescencia je založená na využívaní biologického javu interakčnej reakcie medzi protilátkou a antigén. Musí to urobiť špecificky s vizualizáciou alebo detekciou tejto reakcie, keď vzrušujúce fluorescenčné molekuly pri špecifickej vlnovej dĺžke.

Protilátka je imunoglobulínový proteín vylučovaný z aktívnych B buniek a je špecificky generovaný proti antigénu, ktorý sa dá spojiť s veľkou afinitou a špecifickosťou. Imunofluorescencia využíva imunoglobulíny IgG, ktoré sa nachádzajú rozpustné v krvnom sére.

Protilátky sú molekuly až do 950 kDa zložené z dvoch krátkych peptidu (svetlo) a dvoch dĺžok vo forme „y“ (ťažké). Ľahké aj ťažké reťazce sú rozdelené do dvoch domén: jedna premenná, schopná rozpoznať antigén a druhá konštantná alebo zachovaná, charakteristická pre každý druh.

Antigény sú funkčne definované ako molekuly, ktoré môžu byť rozpoznávané protilátkou a sú to väčšinou proteíny. Ak je zviera vystavené antigénu, aktivujú sa lymfocyty imunitného systému, čím sa proti nemu produkujú špecifické protilátky a fungujú ako obranný systém.

Antigén, ako napríklad proteín, môže mať viac ako jeden epitop alebo miesto rozpoznávania protilátky, takže sérum zvieraťa vystaveného antigénu môže mať polyklonálne protilátky proti rôznym oblastiam toho istého proteínu.

Môže vám slúžiť: epidermis cibule

Imunofluorescencia teda využíva schopnosť zvieraťa vyrábať polyklonálne protilátky proti špecifickému antigénu, aby sa ho očistil a neskôr ho použil na detekciu toho istého antigénu v iných kontextoch.

Among the most used fluorescent dyes or molecules for some immunofluorescence techniques are fluorescein isootiocyanate (FITC), tetramethylrodamine-5 and 6 (tritc) isochianate, many cyanines such as Cy2, Cy3, Cy5 and Cy7 and dyes called Alexa Fluor® , like the Alexa Fluor®448.

Protokol

Imunofluorescenčný protokol sa líši v závislosti od mnohých faktorov a všeobecne, zahŕňa lineárnu sekvenciu krokov pozostávajúcich z:

• Príprava listov a buniek
• Fixácia vzorky
• Permeabilizácia
• Blokovanie
• Imunotívny alebo imunomarcaje
• Montáž a pozorovanie

-Príprava

Vzorky

Príprava vzoriek bude závisieť od ich povahy a druhu skúseností, ktoré sa majú vykonať. Ďalej bude vysvetlený najjednoduchší prípad, ktorý naznačuje použitie suspendovaných buniek.

Bunky suspenzie, tj v kvapalnom kultivačnom médiu, sa musia najskôr oddeliť odstredením a potom by sa mali premyť tlmivým roztokom alebo “vyrovnávacia pamäť izosmotický, ktorý zachováva svoju integritu.

Normálne sa tlmivý roztok fosfátu sa používa ako PBS, v ktorom sú bunky resuspend.

Listy

Stretne sa musia starostlivo pripraviť aj listy použité na mikroskopické pozorovanie, kde budú bunky nastavené na zodpovedajúce ošetrenia po prúde, tiež.

Sú zakryté alebo „senzitizované“ s polysínovým roztokom, syntetickým polymérom, ktorý bude slúžiť ako „molekulárne lepidlo“ medzi bunkami a tuhej podpore, vďaka elektrostatickej interakcii medzi pozitívnymi nábojmi ich aminoskupín a negatívnym zaťažením proteínov, ktoré pokrývajú proteíny, ktoré pokrývajú bunky.

Fixácia vzorky

Tento proces spočíva v imobilizácii proteínov, ktoré sú v bunkovom interiéri, aby sa ich priestorové umiestnenie nedotkli. Použité molekuly by mali byť schopné prekrížiť všetky typy bunkových membrán a tvoriť rámy s kovalentnými proteínmi.

Formaldehyd a paraformaldehyd, glutaraldehyd a dokonca aj metanol sa používajú, s ktorými sa vzorky buniek inkubujú na určitý čas a potom ich umývajú izosmotickým roztokom pufra.

Po fixácii buniek sa k nim naďalej spája s predtým senzibilizovanými listami s polysínom.

Permeabilizácia

V závislosti od typu vykonaného testu bude potrebné permeabilizovať alebo nie študované bunky. Ak sa hľadá, je poznať miesto, prítomnosť alebo neprítomnosť určitého proteínu na bunkovom povrchu, permeabilizácia nebude potrebná.

Môže vám slúžiť: fosfatidylinozitol: štruktúra, tréning, funkcie

Na druhej strane, ak chcete poznať umiestnenie proteínu vo vnútri bunkového interiéru, permeabilizácia je nevyhnutná a bude pozostávať z inkubácie vzoriek s Triton X-100, detergent schopný permeabilizujúcich bunkových membrán.

Blokovanie

Základný krok vo všetkých imunologických technikách blokuje. V tejto fáze procedúry blokáda spočíva v pokrytí, v senzibilizovaných listoch, všetky miesta s molekulami polyesínu, ku ktorým neboli bunky priľnavé. To znamená, že bráni každej nešpecifickej únii.

Normálne sa na blokovanie roztokov s albumínom srvátkovej hovädzieho hovädzieho mäsa (BSA) sa používajú v pufri PBS a najlepšie výsledky sa získajú, čím dlhšie je inkubačný čas s týmto riešením. Po každom kroku, vrátane blokády, je potrebné odstrániť zostávajúce roztok umytím.

Imunotívny alebo imunomarcaje

Imunomariness alebo imunomariness postup bude závisieť hlavne, ak je to priama alebo nepriama imunofluorescencia (pozri neskôr).

Ak je to primárna alebo priama imunofluorescencia, vzorky sa inkubujú s požadovanými protilátkami, ktoré musia byť spojené s fluorescenčnými farbivami. Inkubačný postup spočíva v tom, že sa zriedite protilátkou v roztoku, ktorý bude BSA tiež obsahovať, ale v nižšom pomere.

Ak ide o prípad sekundárnej alebo nepriamej imunofluorescencie, musia sa vykonať dve po sebe idúce inkubácie. Najprv s požadovanými protilátkami a potom s protilátkami, ktoré sú schopné detegovať konštantné oblasti primárnych imunoglobulínov. Sú to tieto sekundárne protilátky, ktoré sú spojené kovalentne na fluorofory.

Táto technika je veľmi všestranná a umožňuje súčasné známky viac ako jedného antigénu na vzorku, pokiaľ majú primárne protilátky spojené s rôznymi fluoroformi, v prípade priamej imunofluorescencie.

Pre súčasné značky v nepriamej imunofluorescencii je potrebné.

Rovnako ako blokáda, aj inkubácia s protilátkami poskytuje lepšie výsledky, tým väčší čas tohto. Po každom kroku je potrebné umyť prebytočné protilátky, ktoré sa nepripojili k vzorkám a v sekundárnej imunofluorescencii je potrebné blokovať pred pridaním sekundárnej protilátky.

Niektoré techniky používajú iné farbivá, ktoré nemajú nič spoločné s imunomariness, ako je napríklad farbenie jadrovej DNA s fluoroforom DAPI.

Montáž a pozorovanie

Počas posledného času inkubácie s fluoroformi je potrebné, aby vzorky zostali v tme. Pre pozorovanie mikroskopu je bežné.

Chlapci

Grafické zhrnutie priamej a nepriamej imunofluorescencie (Zdroj: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licencie/By-SA/4.0)] Via Wikimedia Commons)

Priama alebo primárna imunofluorescencia

Súvisí s detekciou antigénov pomocou fluorescenčných protilátok. Hlavnou výhodou použitia tejto techniky je jej rýchlosť, avšak v procese sa môže vyskytnúť veľa prípadov nešpecifickej únie, najmä pri štúdiu ľudských sérov, pretože sú bohaté na veľmi heterogénne protilátky.

Môže vám slúžiť: 5 vetiev hlavnej biotechnológie

Nepriama alebo sekundárna imunofluorescencia

Je tiež známa ako „sendvičová“ technika, čo znamená vývoj techniky v dvoch krokoch. Prvá súvisí s použitím nefluorescenčnej protilátky a jej spojenia k antigénu záujmu.

Proti konštantnej oblasti tejto prvej protilátky (ktorá bude teraz slúžiť ako antigén) druhá protilátka schopná rozpoznať sa, ktorá sa používa, ktorá je spojená s fluorescenčnou molekulou.

Vzhľad fluorescenčného signálu bude výsledkom špecifického rozpoznávania medzi prvou nefluorescenčnou protilátkou a antigénom, ktorý je predmetom záujmu; Prítomnosť týchto prvých podmienok protilátky, ktorá je v druhej, ktorá je označená a vďaka ktorej je možné určiť prítomnosť alebo neprítomnosť antigénu.

Napriek tomu, že je to technika, ktorá spotrebúva oveľa dlhšie ako priama imunofluorescencia (pretože obsahuje viac inkubačných krokov), táto technika neznamená návrh fluorescenčnej protilátky pre každý študovaný antigén, čo je z ekonomického hľadiska životaschopnejšie.

Okrem toho ide o citlivejšiu techniku, pokiaľ ide o amplifikáciu signálu, pretože viac ako jedna sekundárna protilátka sa môže spojiť s konštantnou oblasťou primárnej protilátky, čím sa zvyšuje intenzita fluorescenčného signálu.

Žiadosti

Ako už bolo uvedené, imunofluorescencia je mimoriadne všestranná technika, ku ktorej sa podávala multiplicita použitia vo vedeckých a klinických oblastiach. Môže sa použiť na zodpovedanie ekologických, genetických a fyziologických otázok týkajúcich sa mnohých organizmov.

Medzi klinickými aplikáciami sa používa na priamu diagnostiku niektorých dermatologických chorôb, či už s použitím priamej alebo nepriamej imunofluorescencie na epitelovom tkanive pacientov študovaných.

Imunofluorescenčné techniky boli usporiadané v jednobunkových organizmoch, ako sú kvasinky, na vizualizáciu intranukleárnych a cytoplazmatických mikrotubulov, aktínu a pridružených proteínov, 10nm vlákien a iných zložiek cytoplazmy, membrány a bunkových stien.

Odkazy

1. Abcam, imunocytochémia a imunofluorescenčný protokol. Zdroj z Abcam.com
2. Gref, c. (2012). Fluorescenčné farbivá. Zdroj: Leica-mikrosystems.com
3. Miller, D. M., & Shakest, D. C. (Devätnásť deväťdesiatpäť). Imunofluorescenčná mikroskopia. V Metódy v bunkovej biológii (Zv. 48, pp. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ja. D., & Cook, D. (2013). Imunofluorescenčné techniky. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1-4.
5. Princ, b. J. R., Adams, a. A. M., Druain, D. G., & Brian, K. (1991). Imunofluorescenčné metódy pre YEAS. V Metódy enzymológie (Zv. 194, str. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, m., Orsi, e. V, & widelock, D. (1964). Aplikácia imunoflorencie v virologii v oblasti verejného zdravia. Bakteriologické recenzie, 28(4), 402-408.
7. Vrieling, e. G., & Anderson, D. M. (Devätnásť deväťdesiat šiestich). Imunofluorescencia vo fytoplanktonovom výskume: aplikácie a potenciál. J: Phycol., 32, 1-16.