DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol), nadácia, použitie

On DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Je to farbivo, ktoré svojou fluorescenčnou vlastnosťou slúži ako marker, ktorý sa široko používa v technike fluorescenčnej alebo prietokovej cytometrickej mikroskopickej techniky. Fluorescencia, ktorú emituje, je jasne modrá, jej vzrušenie sa vyskytuje medzi 455-461 nm (UV svetlo).

DAPI farbivo môže s veľkou ľahkosťou prekročiť bunkovú membránu z mŕtvych buniek. Môžete tiež zafarbiť jadrá živých buniek, ale v tomto prípade musí byť koncentrácia väčšia.

Chemická štruktúra fluorescenčného dystu. Zdroj: obrázok: Súbor: DAPI.SVG je vektorová verzia tohto súboru. Mal by sa používať namiesto tohto rastrového obrazu, keď nie je nižší/Richard Wheeler (Zephyris) [CC By-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licencie/By-SA/3.0/)] Upravený obrázok

Farbivo je schopné získať prístup k bunkovej DNA, prostredníctvom ktorej má špeciálnu afinitu, spájajúca sa s veľkou aviditou s adenínovými a tymínovými dusíkovými základňami. Z tohto dôvodu je veľmi užitočný pri niektorých technikách molekulárnej biológie.

Táto zlúčenina patrí do skupiny indolických farbív a preukázala sa, že má väčšiu citlivosť na DNA ako bromid etídium a propagujúci jodid, najmä o agarózových géloch.

Použitie tohto fluorescenčného farbiva je veľmi široké, pretože je užitočné pre: štúdium zmien v DNA v apoptotických procesoch (bunková smrť), a preto detegovať bunky v tomto procese; Pre fotografiu Footprinting DNA (fotografická tlač DNA); študovať bakteriálnu kontamináciu; o vizualizovať jadrovú segmentáciu.

Používa sa tiež pri štúdiu chromozomálnych pásov, pri detekcii DNA Mycoplasmas SP, Pri interakcii DNA-proteín, pri farbení a počítaní buniek imunofluorescenciou a dokonca sfarbenie zrelý peľový zrn.

[TOC]

Charakteristika

DAPI je skratka jeho chemického názvu (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Jeho molekulárny vzorec je C₁₆H_pätnásťN_5. Má molekulovú hmotnosť 350.3. V blízkosti rozsahu UV svetla (345 až 358 nm) sa vyskytuje maximálna excitácia komplexu DAPI-ADN, zatiaľ čo maximálna fluorescenčná emisia sa vyskytuje medzi 455-461 nm.

Toto farbivo sa vyznačuje tým, že je žltý prach, ale štruktúry označené týmto fluoroforom emitujú jasne modré svetlo.

Je to však zlúčenina rozpustná vo vode na urýchlenie jeho rozpustenia, je možné aplikovať určité teplo. Môže sa zriediť PBS, ale nie rozpustenie priamo do toho.

Môže vám slúžiť: kyselina arzenioso (H3SO3): Vlastnosti, riziká a použitia

Akonáhle sa farbivo pripraví, musí sa skladovať v tme, tj chránený pred svetlom, pri teplote 2 až 8 ° C (chladnička). Za týchto podmienok je farbivo stabilné viac ako 3 týždne alebo mesiace.

Ak je svetlo chránené, ale jeho stabilita je ponechaná pri teplote miestnosti na 2 alebo 3 týždne, ale vystavená priamemu svetlu je zhoršenie veľmi rýchle. Ak chcete ušetriť oveľa dlhšie, môžete chladiť pri -20 ° C distribuovaným v alikvotoch.

Základ

Toto sfarbenie je založené na vytváraní jadrového prenájmu v hlavných technikách molekulárnej biológie, ako je: prietoková cytometria, fluorescenčná mikroskopia a farbenie metafazických chromozómov alebo jadier rozhrania.

Táto technika je založená na veľkej afinite, ktorú má farbivo pre dusíkavé bázy (adenín a timin) obsiahnuté v genetickom materiáli (DNA) v menšej drážke. Zatiaľ čo na cytoplazmatickej úrovni necháva veľmi málo dna.

Keď dôjde k spojeniu fluorescenčného farbiva do oblastí adenínu a Timiny DNA, fluorescencia sa výrazne zvyšuje (20 -krát viac). Farba, ktorú vyžaruje, je jasne modrá. Je potrebné poznamenať, že pri väzbe na páry báz GC nedochádza k emisii fluorescencie (guanina-citosín).

Je dôležité zdôrazniť, že hoci má tiež afinitu k RNA, nespôsobuje to problém, pretože väčší stupeň emisie energie tejto molekuly sa vyskytuje pri inej vlnovej dĺžke (500 nm), na rozdiel od DNA, ktorá to robí na 460 nm. Okrem toho zvýšenie fluorescencie, keď je spojená s RNA, je iba 20%.

DAPI sa používa viac na farbenie mŕtvych (fixovaných) buniek, ktoré žijete, pretože na farbenie je potrebná oveľa vyššia koncentrácia farbiva, je to preto, že bunková membrána je pre DAPI oveľa menej priepustná, keď je nažive.

DAPI farbivo sa môže použiť v kombinácii s červenými a zelenými fluoroformi na získanie viacfarebného zážitku.

Využitie

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) je vynikajúci fluorofor, a preto sa široko používa v rôznych technikách a na rôzne účely. Použitie DAPI je vysvetlené nižšie v hlavných technikách.

Prietoková cytometria

Vedci Gohde, Schumann a Zante v roku 1978 boli prví, ktorí použili a navrhli DAPI ako fluorofor v technike prietokovej cytometrie, mali veľký úspech v dôsledku ich vysokej citlivosti DNA a jeho vysokej intenzity pri emisii fluorescencie.

Môže vám slúžiť: aminoskupina (NH2): štruktúra, vlastnosti, príklady

Použitie DAPI v tejto technike umožňuje štúdium bunkového cyklu, kvantifikáciu buniek a farbenie živých a mŕtvych buniek.

Aj keď existujú aj iné farbivá, ako napríklad etídiumbromid, oxid Hoechst, akridín oranžová a propidio jodid, DAPI je jedným z najviac používaných na to, aby bol viac fotografický ako tie, ktoré sú uvedené vyššie.

Pre túto techniku ​​je to potrebné. Vzorka je odstredená a supernatant je zlikvidovaný.

Kým čas prechádza farbivo DAPI s farbiacim pufrom (FOXP3 Biolegend) na 3 um.

Centrifugue vzorka, zlikvidujte supernatant a potom zakryte 1 ml roztoku DAPI počas 15 minút pri teplote miestnosti.

Vzorku odneste do prietokového cytomepu s pravým laserom.

Mikrofluórmetria prietoku

Ďalšia technika, pri ktorej sa DAPI používa. Obe sú užitočné na kvantifikáciu.

Hybridizácia In situ 

Táto technika v podstate používa DNA sondy označené fluorescenčným farbivom, ktorý môže byť DAPI.

Vzorka vyžaduje, aby sa ošetrela teplom na denaturalizáciu DNA tried a zmenila ju na dva monocypenárne reťazce. Následne je hybridizovaný s dňovou DNA sonda označenou DAPI, ktorá má záujmovú sekvenciu.

Následne sa premyje, aby sa eliminoval to, čo nebolo hibrid, kontrast sa používa na vizualizáciu DNA. Fluorescenčný mikroskop umožňuje pozorovanie hybridizovanej sondy.

Táto technika je určená na detekciu špecifických sekvencií v chromozomálnej DNA, ktorá je schopná diagnostikovať určité choroby.

Tieto cito-molekulárne techniky boli užitočné pri určovaní podrobností pri štúdiu karyotypov. Napríklad preukázalo regióny bohaté na páry adenozínových a tymínových báz nazývaných heterochromatické oblasti alebo pásma DAPI.

Môže vám slúžiť: Priepustnosť: koncept, jednotky, faktory, príklady

Táto technika sa široko používa na štúdium chromozómov a chromatínu u rastlín a zvierat, ako aj pri diagnostike prenatálnych a hematologických patológií v ľudskom.

V tejto technike je odporúčaná koncentrácia DAPI 150 ng/ml po dobu 15 minút.

Už namontované sklíčka by mali byť chránené pred svetlom pri 2 až 8 ° C.

Farbenie imunofluorescencie

Bunky sú fixované 4% paraformaldehydom. Ak sa použijú iné farbivá, DAPI sa na konci ponecháva, pretože prijímanie a bunky s roztokom PBS počas 15 minút sú zakryté. Zatiaľ čo čas uplynie, pripravte roztok DAPI zriedením PBS, takže konečná koncentrácia je 300 µm.

Potom sa prebytok PBS extrahuje a pokryje DAPI po dobu 5 minút. Umyť niekoľkokrát. List je pozorovaný vo fluorescenčnom mikroskope pod správnym filtrom.

Bezpečnostný list

Táto zlúčenina musí byť starostlivo manipulovaná, pretože ide o zlúčeninu, ktorá má mutagénne vlastnosti. Aktívny uhlie sa používa na odstránenie tejto zlúčeniny vodných roztokov, ktoré sa vyradia.

Rukavice, rúcho a bezpečnostné šošovky by sa mali používať, aby sa predišlo nehodám s týmto činidlom. Ak dôjde k kontaktnému alebo slizničnému kontaktu, mali by ste oblasť umyť dostatočným množstvom vody.

Nikdy by ste nemali potrieť toto činidlo s ústami, používajte propipy.

Nespontajujte činidlo mikrobiálnymi látkami, pretože to bude mať za následok chybné výsledky.

Nenechajte farbivo DAPI viac ako odporúčané, pretože kvalita farbenia sa výrazne zníži.

Nevyhadzujte činidlo na priame svetlo alebo udržiavajte teplo, pretože znižuje fluorescenciu.

Odkazy

1. Brammer S, Toniazzo C a Poersch L. Bežne podnikateľom cholars na zeleninová cytogenetika. ARQ. Inštancia. Biol. 2015, 82. K dispozícii od: SCIELO.
2. Laboratóriá spoločnosti Imtath. Dapi. K dispozícii na: Menarinidiagnostics.com/ com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Pokyny na použitie DAPI. K dispozícii v Cycelle.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Koncepty a techniky v ekológii rieky. (2009). Redakčné rubes, Španielsko. K dispozícii na: Knihy.Riadenie.co.ísť/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Použitie fluorescencie v modifikovanej metóde disektora na odhad počtu myocytov v srdcovom tkanive. ARQ. Podprsenka. Kardiol. 2012; 98 (3): 252-258. K dispozícii od: SCIELO.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valerencia P. Prítomnosť fytoplazmy v papayo (Carica Papaya) v Mexiku. Časopis. Zástankové série, 2011; 17 (1), 47-50. K dispozícii na: SCIELO.orgán.