Nadácia oxidázy, postup a použitie

Ten oxidáza Je to diagnostická metóda, ktorá ukazuje prítomnosť enzymatického komplexu nazývaného cytochróm oxidáza C. Tento systém indukuje transformáciu redukovaného na oxidovaný cytochróm, pretože zachytáva kyslík a to zase pôsobí ako posledný akceptor elektrónov (H⁺) V respiračnom reťazci.

Oxidázový výraz je súhrnný spôsob odkazu na enzým oxidázy cytochrómu, známy tiež ako oxidáza neurčitý. V staroveku sa verilo, že enzýmy cytochróm oxidázy a indefenol oxidázy boli dva rôzne enzýmy, ale dnes je známe, že sú rovnaké.

Pozitívny a negatívny test oxidázy. Zdroj: K dispozícii nie je žiadny stroj na čítanie stroja. Alfa.Primmonswiki predpokladal (na základe nárokov na autorské práva). [Verejná doména]

Pokiaľ ide o ich, cytochrómy sú hemoproteíny, ktoré obsahujú železo a dokončujú systém cytochrómu oxidázy. Cytochrómy sa môžu líšiť v závislosti od jedného druhu k druhému.

Existujú rôzne odrody cytochrómov (cytochrómy A1, A2, A3 a 0). Niektoré baktérie môžu produkovať iba jednu, ale iné do dvoch alebo troch súčasne. V tomto zmysle je prítomnosť cytochrómu A a A3 známa ako cytochróm - oxidáza C. Toto je typ cytochrómu, ktorý detekuje test oxidázy.

Žánre Neisseria a Pseudomonas obsahujú oxidázu C cytrocrome. Tieto žánre poskytujú pozitívny oxidázový test a pomáhajú ich odlíšiť od žánrov Acinetobacter a Stenotrofomonas.

Existujú aj ďalšie žánre, ktoré sú pozitívne oxidázy.

[TOC]

Základ

Charakteristiky cytochrómu oxidázového systému C

Oxidázový cychokómový systém C pôsobí nasledovne: pozitívne oxidázové mikroorganizmy používajú kyslík na výrobu energie prostredníctvom aeróbneho dýchania. Tento systém funguje vďaka preprave elektrónov z darcovských látok, ako je NADH⁺ Smerom k prijímaniu látok, v tomto prípade kyslík.

To má za následok energiu (ATP) a peroxid vody, v závislosti od systému oxidázy cytochrómu, ktorý má mikroorganizmus.

Z tohto dôvodu je väčšina pozitívnych oxidázových baktérií tiež pozitívnou katalázou, čo je nevyhnutný stav na odstránenie peroxidu vodíka, pretože táto látka je toxická pre baktérie.

Cycrómový systém oxidázy C je prítomný v niektorých aeróbnych baktériách, určitých voliteľných anaeróbnych, vzácnych mikroaerofilných a žiadnych prísnych anaeróbnych. Posledne menované je pochopiteľné, pretože prísne anaeróby nemôžu žiť v prítomnosti kyslíka, preto im chýba systém cytochrómu oxidázy.

Zásada dôkazu

V tomto teste používajú látky, ktoré pôsobia ako umelé elektrónové akceptory, nahradenie domorodcov v rámci elektrónového transportného reťazca.

Používajú sa hlavne farbivá, ako je parafenylendiamín a indofenol, ktoré pôsobia ako receptorové substráty a umelých darcov elektrónov.

Parafenyndiamín je oxidovaný systémom cytokrom oxidázy C. Farbivo vo svojej redukovanej forme je bezfarebné, ale vo svojej oxidovanej forme je zafarbené.

Takto prítomnosť cytochrómu oxidázy C; Pozitívna reakcia bude generovať levanduľové alebo modré sfarbenie -púrpura v závislosti od použitého činidla.

Môže vám slúžiť: paleobiológia: história, špeciality, objavy

Na druhej strane, ak je posledná látka akceptorov elektrónov v respiračnom reťazci odlišná od kyslíka, test oxidázy poskytne negatívny (nedochádza k výrobe farieb); Toto je prípad anaeróbnych mikroorganizmov.

Podobne, ak je cytochróm používaný mikroorganizmom odlišný od cytochrómu oxidázy C, poskytne tiež negatívny test.

Postup

Pre test oxidázy je niekoľko reagencií a protokolov, všetko s rovnakým účelom.

Činidlá

Kovacs Reactive, Gordon a McLeod Reagent, Nadi Reagent, Carpenter Reagent, Suhrland a Morrison a použitie oxidázových diskov.

-Kovacs oxidázové činidlo

Skladá sa z tetrametyl-p-fenylendiamínového dichlórhydrátu pri 1%.

Kovacsové činidlo sa pripravuje rozpustením 1 g látky uvedenej v 50 ml destilovanej vody. Je jemne zahrievaná až do celkového roztoku. Preneste na jantárovú fľašu s dostatočnou kapacitou a dokončite objem pri 100 ml destilovanou vodou. Pred použitím počkajte najmenej 15 minút. Ušetrite v chladničke chránené pred svetlom.

Otáča sa ako Kovacs oxidázové činidlo, aby sa odlíšila od kovacsa, ktorý sa používa na odhalenie testu indolu. Toto činidlo je najcitlivejšie, menej toxické, ale drahšie ako ostatné reagencie.

Pozitívnou reakciou bude dôkaz. Dôkazom je negatívna reakcia, pretože v kolónii nedochádza k žiadnej zmene farby alebo vyžaduje mierne ružové sfarbenie. Médium môže tiež stmaviť, ale to neznamená pozitívnu reakciu.

S týmto činidlom je reakčný čas rozhodujúci, táto zmena farby, ku ktorej dochádza medzi 5 až 15 sekundami, sa považuje za pozitívnu reakciu.

-Reagent Gordon a McLeod

Je zložený z dimetyl-p-fenylendiamínového dichlórhydrátu, známy tiež ako N-dimetyl-P-fenylendiamín alebo p-amynimetylanilín p-amocorhydrát. Je pripravený, ako je opísané pre činidlo Kovacs oxidázy, nahradenie príslušnej látky.

Toto činidlo je o niečo stabilnejšie ako činidlo Kovacs oxidázy, hoci všetky činidlá obsahujúce p-penilendiamín sú nestabilné.

Táto reakcia je neskoro.

-Nadi činidlo

Zkladá sa z 1% a-naftolu v etylalkoholu (95% etanol) a 1% amin-limylin. Zmes sa pripravuje v rovnakých častiach a používa absolútnu etylalkohol ako usadeninu, až kým sa nedostatočné množstvo nedokončí na 100 ml.

-Carpenter Reactive, Suhrland a Morrison

Zkladá sa z 1% p-amynodimetylalanínu oxalát. Pripravte sa rovnakým spôsobom na to, čo je opísané pre kovacs oxidázové činidlo, mení sa pre zodpovedajúcu látku.

Môže vám slúžiť: potravinový reťazec džungle

Pri pripravenom roztoku sa reaktívne prúžky pripravujú nasledovne: Whatman 6-8 cm číslo 1.

Nechajú sa vyschnúť bez kontaktu s kovom, s výnimkou závitu pohárov s vysušením a držte sa v chladničke. Tieto prúžky sú stabilné až 6 mesiacov.

Je to najstabilnejšie činidlo zo všetkých spomenutých, ktoré dokážu vydržať v roztoku až do 6 mesiacov. Ďalším bodom v prospech je to, že médium nefarbí okolo kolónie, ak sa používa priamo na tanier.

Vzhľad červenej farby sa interpretuje ako pozitívny test.

-Oxidáza

Sú to komerčné disky, ktoré sú impregnované činidlom na test oxidázy. Na trhu je niekoľko komerčných značiek.

Jeho použitie je celkom praktické, pretože nesmieme pripravovať čerstvé činidlá, ktoré uľahčujú prácu. Získané výsledky sú spoľahlivé, pokiaľ sú disky správne zachované.

Protokoly

Metóda priamej dosky, nepriama metóda na papieri a použitie impregnovaných diskov s oxidázovými činidlami.

-Metóda priameho taniera

2 alebo 3 kvapky ktoréhokoľvek z vyššie uvedených činidiel sa pridávajú na tento účel priamo na kolóniách (-ov) obsiahnutých v kultivačnej strednej doske, ktorá neobsahuje glukózu.

Zmena alebo nie farba kolónií sa interpretuje, nie médium. Platný reakčný čas závisí od použitého činidla.

-Nepriama metóda na papieri

Odrežte kúsok filtračného papiera (Whatman n ° 1) na veľkosť 6 cm² A je umiestnený vo vnútri prázdneho Petriho.

Pridajte 2 alebo 3 kvapky činidla Kovacs oxidázy na papieri, zúčastnite sa kolónie, ktorú chcete študovať pomocou platinovej rukoväte alebo drevenej tyčinky a natiahnite ju v priamke na impregnovanom činidlovom papieri. Interpretovať v období 5 až 10 sekúnd.

S prúžkami pripravenými s Carpenterom, Suhrland a Morrison Reagent sa na suchom pásme rozširuje kolónia. Rovnaký pás slúži na vyskúšanie niekoľkých kmeňov. Interpretovať 10 sekúnd.

-Disky (mpriamy etod)

Jemne navlhčiť komerčné disky sterilnou destilovanou vodou a prekonajte kolóniu do štúdia. Odporúča sa používať doštičky pri 35 ° C, ak sa doštičky používajú pri teplote miestnosti alebo v chladiacich doskách, reakcia je o niečo pomalšia. Interpretujte zmenu farby medzi 10 až 20 sekundami.

Môžu sa použiť kolónie obsiahnuté v krvi alebo čokoláde.

-Disky (nepriama metóda)

Album navlhčiť, ako je opísané vyššie. Položte ho na prázdny Petriho. Vezmite dostatočné množstvo kolónie na štúdium s platinovou rukoväťou alebo drevenou tyčinkou a položte na disk. Interpretujte zmenu farby medzi 10 až 20 sekundami.

Využitie

Rod Neisseria a Acinetobacter sa niekedy podobajú mnohým morfologicky, pretože hoci žáner Acinetobacter je gram negatívny bacil, niekedy môže prijať kokoidnú formu a distribuovať v pároch, simuluje rod neisseriaia.

Môže vám slúžiť: Limnologia

V tomto prípade je test oxidázy skutočne užitočný. Rodová neisseria je pozitívna a negatívna acinetobacter.

Rod Moraxella je však veľmi podobný rodu Neisseria a obidve odpovedajú; Z tohto dôvodu musíme vždy vykonávať testy fermentácie uhľohydrátov na definitívnu identifikáciu.

Na druhej strane je test oxidázy užitočný na rozlíšenie baktérie patriacej rodine Enterobacteriaceae (všetky negatívne oxidázy) iných fermérov, ako je rod pasienky, aeromóny, plesiomonas (pozitívna oxidáza).

Rod Vibrio a Helicobacter sú tiež pozitívny oxidáza.

Qa

Používať známe kmene Escherichia coli ako negatívna kontrola a kmene Pseudomonas aeruginosa ako pozitívna kontrola.

Obmedzenia

-Reagencie sa musia používať čerstvo pripravené, ich životnosť v izbovej teplote je krátka na to, že je veľmi nestabilná. Chlady môže trvať od 5 dní do 2 týždňov.

-Reagenty sú bezfarebné, ak menia farbu, musia byť vyradené. Poškodené disky sú zrejmé, pretože v priebehu času stmavnú.

-Pozitívna reakcia s oxidázovým činidlom Kovacs medzi 15 -60 sekundami sa považuje za oneskorenú reakciu a po 60 sekundách by sa mala považovať za negatívnu.

-On Hemophylus chrípka Poskytuje negatívnu reakciu oxidázy, ak sa používa nejaké činidlo s dimetyl-p-fenylendiamínom, ale pozitívne, ak sa použije oxidázové činidlo Kovacs (tetrametyl-p-fenylendiamín)).

-Médiá obsahujúce glukózu interferujú v teste, nepravdivo negatívne.

-Kmene Bordetella pertussis Môžu nepravdivo pozitívnu reakciu, ak pochádzajú z veľmi koncentrovaných dosiek agarového krvi.

-Použitie kovových rukovätí (železa), ktoré poskytujú falošne pozitívnu reakciu.

odporúčania

-Pretože reagencie sú veľmi nestabilné a majú tendenciu samostatne.

-Ďalším spôsobom, ako oneskoriť samovlažbu činidla, je pridanie 0,1% kyseliny askorbovej v čase prípravy reagencií.

-Pretože reagenty sú nestabilné, odporúča sa vykonávať týždennú kontrolu kvality.

-Nemali by sa používať reagenty, ktoré neprechádzajú testom kontroly kvality.

Odkazy

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. PAN -AMERICKÁ REDICIAL S.Do. Argentína.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld a. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey a Scott. 12 ed. PAN -AMERICKÁ REDICIAL S.Do. Argentína.
3. „Test oxidázy.„ Wikipedia, encyklopédia zadarmo. Január 2018, 10:32 UTC. Apríl 2019, 14:03
4. Svetová zdravotnícka organizácia. Laboratórna príručka na identifikáciu a test náchylnosti na antimikrobiánov baktérijských patogénov dôležitých pre verejné zdravie vo svete rozvoja.2004. K dispozícii na: kto.Int/liek/infosharing
5. Reaktívne prúžky na diagnostiku aktivity oxidázy v baktériách. Kubánsky rev. 2000; 52 (2): 150-151.