Charakteristiky proteinázy K, enzymatická aktivita, aplikácie

Ten proteina k Je to enzým, ktorý patrí do skupiny serínových proteáz, to znamená, že má vo svojom aktívnom katalytickom centre serínovej aminokyseliny a má funkciu prerušenia peptidových väzieb hydrolýzou. Tento enzým na druhej strane patrí do rodiny proteínov subtilisínu (peptidáza S8).

K proteináza má molekulovú hmotnosť (PM) 28.900 daltonov a bol prvý izolovaný v 1.974 v plesňových extraktoch Album Engyodontium, predtým známy ako meno Tritirachium album limber.

Molekulárna štruktúra K proteinázy. Zdroj: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licencie/By-SA/4.0)]

Predstavuje vysokú proteolytickú kapacitu, preukázanú tým, že je schopný degradovať keratín prítomný vo vlasoch. Slovo keratin v angličtine je napísané „keratín“, odtiaľto sa hovorí, že sa nazýva „proteinsa k“.

Vďaka svojej vysokej sile na rozdelenie natívnych proteínov je tento enzým užitočný pri rôznych technikách molekulárnej biológie. Používa sa hlavne na izoláciu a prípravu nukleových kyselín s vysokou molekulovou hmotnosťou (PM).

K proteináza pôsobí uvoľnením jadrovej DNA, zatiaľ čo ničí proteíny a neaktívne na RNázy a dNate, to znamená, že eliminuje nukleas v prípravkoch DNA a RNA.

Na druhej strane sa zistilo, že K proteináza môže hydrolyzovať niektoré denaturované natívne proteíny, čo sa stalo záujmom výskumných pracovníkov na použitie pri štúdiu priónových proteínov (PRPC).

Napriek svojej vysokej proteolytickej sile však existujú proteíny, ktoré sú rezistentné na pôsobenie proteínu K. Medzi nimi sú niektoré anomálne proteíny nazývané Prióny (PRPSC), spojené s prenosnými spongiformnými encefalopatiami.

[TOC]

Charakteristiky proteinázy k

K proteináza má terciárnu štruktúru zloženú z troch vrstiev, s listom siedmich lekárskych reťazcov medzi dvoma vrstvami vrtule. Pretože patrí do rodiny peptidáz S8 sa vyznačuje prezentáciou katalytickej trojice vo svojom aktívnom mieste, ktorého sekvenčný poriadok je (ASP, jeho a bytie), čo ich odlišuje od iných rodín peptidázy.

Môže vám slúžiť: proteínové aminokyseliny

Tento enzým skupiny serínovej proteázy sa vyznačuje hydrolyzujúcimi peptidovými väzbami blízko karboxylovej skupiny alifatických a aromatických aminokyselín.

Na druhej strane je schopná pôsobiť v prítomnosti určitých korozívnych látok, ako je dodecilsulfát sodný (SDS), Tris-HCl a EDTA, ktoré sa používajú na pomoc denaturácii proteínov, čo spôsobuje stratu svojej pôvodnej štruktúry.

Toto je predchádzajúci krok pri príprave proteínov pre techniku ​​elektroforézy. Rozsah pH, ​​do ktorého pôsobí proteinsa K.0 až 12.0), s optimálnym pH medzi 7.5 až 12.0 a jeho izoelektrický bod je 8.9. Ako je vidieť, je aktívny proti veľmi širokej škále pH.

Ďalšou črtou, ktorá vyniká v proteináze K, je jeho stabilita v prítomnosti vysokých teplôt (50 - 60 ° C).

Enzymatická aktivita

K proteinsa potrebuje prítomnosť vápnikových iónov, hoci nemá vplyv na jeho aktivitu, ak je nevyhnutné udržať svoju stabilitu.

Aby K proteinsa vykonala úplné trávenie substrátu, je potrebný približný kontaktný čas od 5 minút až 2 hodiny.

V tomto zmysle však DAZA a spolupracovníci porovnávali čistotu DNA získanej pri niekoľkých expozičných časoch proti K proteináze a dospeli k záveru, že predĺžená inkubácia (do 24 hodín) významne zlepšuje kvalitu DNA.

Teraz, vo vzťahu k koncentrácii použitej enzýmu proteinázy v rôznych protokoloch, je možné povedať, že je veľmi rozmanitý.

Môže sa použiť z veľmi nízkych koncentrácií (5 ug/ml) do 500 ug/ml koncentrácií. Ale najčastejšie pracovné koncentrácie sa pohybujú medzi 50-100 μg /ml, najmä v prípade trávenia proteínov a nukleas. Aj keď na ošetrenie tkaniva je potrebná koncentrácia 2 mg/ml.

Môže vám slúžiť: Easmotherium Sibiricum: Charakteristiky, biotop, fosílie

Žiadosti

Ich aplikácie sú veľmi široké a možno ich zhrnúť v nasledujúcom:

-Používa sa pri štiepení proteínov a extrakcii DNA niekoľkými metódami, ako je: Salting-Out, PK-SDS, cethyl-trityl amoniak (CTAB), modifikovaného octanu draselného a extrakcie jodidu sodného acetát sodného.

-Inaktivácia nukleasov (RNAS a DNAS).

-V technike hybridizácie In situ (Jeho), na pomoc pri uvoľňovaní nukleovej kyseliny, okrem eliminácie nežiaducich proteínov.

-Modifikácia proteínov.

-Na úrovni výskumu v rôznych štúdiách.

Výhody K proteinázy

Uskutočnili sa rôzne porovnávacie štúdie medzi technikami extrakcie DNA, ktoré používajú K proteinázu, s ostatnými, ktoré ho nepoužívajú a všetky dospeli k záveru, že pri použití enzýmu existujú väčšie výhody. Medzi výhodami možno uviesť nasledujúce:

-Získa sa vysoká molekulárna, vysoká kvalita a čistota DNA.

-Extrahovaná DNA je stabilná až 3 mesiace.

Extrahovaná DNA sa môže použiť v nasledujúcich technikách: Southern blot, polymerázová reťazová reakcia (PCR), elektroforéza,.

Proteíny rezistentné na proteinázy

Rôzne výskumy dospeli k záveru, že prióny (toxické proteíny anomálne PRPSC sa líšia od proteínov PRPC (natívny) tým, že sú rezistentné na pôsobenie proteinázy K, zatiaľ čo PRPC sú citlivé na ich účinok.

Iní autori opísali, že v štruktúre PRPS sú citlivé porcie a iní rezistentní voči proteináze K. Obe strany sú však rovnako toxické a infekčné.

Na druhej strane, Bastian a spolupracovníci v roku 1987 izolovali 4 proteíny 28, 30, 66 a 76 kDa z akýchkoľvek Spiroplazma mirum. Ukázalo sa, že sú odolné voči pôsobeniu proteinázy K a tiež mali krížovú reakciu s niektorými priónmi.

Môže vám slúžiť: chemotoxis

Je známe, že tento druh môže spôsobiť dôležité katarakty a neurologické poškodenie a v dôsledku vedeckých nálezov Bastiana sa okrem iného pokúsil súvisieť s týmto mikroorganizmom, keď prenosné spongiformné encefalopatie prenosné prenosné.

Etiológia tejto degeneratívnej neurologickej patológie však v súčasnosti pripisuje priónom.

V tomto zmysle Butler a spolupracovníci v roku 1991 identifikovali a charakterizovali triedu 40 kDa kDa proteinázy -rezistentných z dvoch kmeňov z dvoch kmeňov z dvoch kmeňov Mycoplasma hyorinis. Tento patogén postihuje ošípané, infikujúce ich tkanivá, ale v tomto prípade nedošlo k krížovej reakcii s testovanými väzeniami.

V tomto ohľade sa vyžaduje viac výskumu na objasnenie mnohých neznámych.

Odkazy

1. Bastian F, Jennings R a Gardner W. 1987. Krížové reakcie s proteínom s protivníkom na scrapiu Spiroplasma mirum Vláknité proteíny. J. Klin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Vyhodnotenie metódy extrakcie a čistenia DNA zo svalového tkaniva fixovaného vo formaldehyde neidentifikovaných mŕtvol.  Prezerať, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evano S, Stanbridge E a McGarrity G. Identifikácia a charakterizácia proteínovo-rezistentných proteínov v členoch Mollicutes triedy.  Infekcia a imunita, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Marokoima A, Herrera L, a kol. Porovnanie dvoch protokolov extrakcie DNA Trypanosoma cruzi kultivované v axhenickom médiu. Otáčať sa. Peru. Prezerať. Expedovať. Verejné zdravie  2014; 31 (2): 222-227. K dispozícii na: SCIELO.orgán
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E a Palma W. Stanovenie účinnosti piatich protokolov extrakcie DNA z parafinovaného materiálu pre molekulárne štúdie. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.