Bradfordská metóda Čo je, princíp, reagencie, používa

On Bradfordská metóda Je to kolorimetrická metóda, ktorá sa v súčasnosti používa na rýchly odhad celkovej koncentrácie proteínu vo vzorkách biologických experimentov. Používa sa v mnohých oblastiach biologického, lekárskeho, veterinárneho, agronomického výskumu atď.

Je známa ako „Bradfordská metóda“, pretože ju prvýkrát opísala Marion Bradford v roku 1976, vo svojej publikácii s názvom Rýchla a citlivá metóda na kvantifikáciu proteínov v množstvách mikrogramov pomocou princípu proteín-jouth.

Fotografia plaku Elisa, kde sa vzorky pripravili na kvantifikáciu Bradfordu (zdroj: Helito, CC BY-SA 4.0, cez Wikimedia Commons)

Od svojho návrhu bola táto metóda popularizovaná, pretože je uznávaná citlivejšia ako iné metódy kvantifikácie proteínov (napríklad Lowry a Biuret); stabilnejšia komplexná forma a je ekonomická a ľahko sa vykonáva.

Okrem toho sa ukázalo, že činidlá, ktoré používajú.

[TOC]

Zásada metódy

Bradfordova metóda je založená na kvantifikácii zmien farieb v roztoku v dôsledku spojenia - v kyslých podmienkach - proteínových molekúl vzorky s molekulami špeciálneho farbiva: Coomassie Blue Brilantná modrá G250.

Keď sa toto farbivo pridá do proteínového roztoku, viaže sa na tieto molekuly prostredníctvom elektrostatických síl a táto reakcia sa prejavuje ako červenkastá hnedá farba na modrú na modrú farbu.

Proteíny a aminokyseliny

Rovnako ako telo tvorí mnoho buniek a nukleové kyseliny (ako je DNA a RNA) sa tvoria nukleotidmi, proteíny sa tvoria usporiadanými sekvenciami niektorých molekúl známych ako aminokyseliny.

Aminokyselina je molekula zložená z centrálneho atómu uhlíka, ku ktorému sú spojené 4 rôzne chemické skupiny: atóm vodíka, karboxylová skupina, aminoskupina a skupina alebo postranný reťazec, ktorý dáva identitu identitu.

Existuje 20 aminokyselín, ktoré sú bežné pre všetky proteíny, ktoré sa navzájom líšia vzhľadom na vlastnosti svojich bočných skupín: existujú základné aminokyseliny, kyseliny, polárne, apolárne, cyklické, aromatické atď.

Môže vám slúžiť: Šelfordov zákon o tolerancii: Čo je a príklady

Súčet charakteristík týchto aminokyselín a poradia, v ktorom sa spájajú, aby vytvorili proteínovú štruktúru.

Komplex

Bradfordova metóda teda kvantifikuje prítomnosť aminokyselinových zvyškov základných charakteristík v biologických vzorkách, najmä aminokyselín, ako je arginín, lyzín a histidín, ktoré sú ľahšie prispôsobené Coomassie Blue.

Zmeny farieb sú kvantifikované ako variácie absorbancie vzoriek, ktoré sa meria pomocou spektrofotometra upraveného na vlnovú dĺžku 595 nm.

Čo je absorbancia?

Je tiež známa ako optická hustota a definuje množstvo svetla, ktoré je absorbované roztokom. Táto absorpcia závisí od vlnovej dĺžky svetla použitého na ožarovanie roztoku, pretože nie všetky molekuly sú schopné absorbovať rovnakú vlnovú dĺžku.

Tento fenomén bol zhrnutý v zákone známeho ako zákon piva-Lamberta, ktorý stanovuje vzťah medzi poklesom množstva svetla, ktoré prechádza látkou a vlastnosťami uvedenej látky.

Napríklad, keď sa svetlo prenáša roztokom, existujú dve miery intenzity: intenzita dopadu (pred krížením roztoku) a prenosná intenzita (všeobecne nižšia, čo zodpovedá frakcii svetla, ktoré nebolo absorbované roztokom).

Vzťah medzi oboma hodnotami je známy ako spracovanie a má hodnoty medzi 0 a 1 alebo je vyjadrený percentuálnym výrazom.

Absorbancia súvisí so spracovaním logaritmického spôsobu a zákon Beer-Lambert navrhuje lineárny vzťah medzi absorbanciou roztoku a jeho koncentráciou, jeho koeficientom molárneho vyhynutia a optickým koeficientom roztoku; Matematická rovnica opisujúca tento zákon je nasledovná:

Môže vám slúžiť: Škodlivá fauna: Príčiny šírenia, dôsledky, kontrola

A (Absorbancia) = ε (koeficient molárneho vyhynutia) C (koncentrácia) L (dĺžka ľahkého priechodu)

Koncentrácia roztoku sa vypočíta vyčistením, ktorá je známa ako neznáma rovnica a vykonanie príslušných výpočtov (C = A/εL)

Čo je spektrofotometer?

Je to zariadenie, ktoré sa používa na kvantifikáciu množstva svetla (v závislosti od vlnovej dĺžky), ktoré absorbuje molekuly v roztoku alebo, inými slovami, množstvo svetla, ktoré prechádzajú.

Spektrofotometre fungujú tak, že vydávajú lúč svetla (viditeľné alebo ultrafialové), ktoré prechádza hranolom (alebo zariadením známe ako monochromátor difrakčnej siete) To ho rozdeľuje v rôznych vlnových dĺžkach, ktoré ju tvoria, čo umožňuje „vybrať“ konkrétnu dĺžku.

Toto svetlo prechádza špeciálnou trubicou, ktorá obsahuje vzorku, ktorá sa analyzuje a následne dosiahne detektor, ktorý vníma množstvo svetla, ktoré sa prenáša z uvedenej vzorky (ktorá nebola absorbovaná), ktorá sa dá pozorovať neskôr vďaka „tlmočníkovi“ má grafické rozhranie.

The Farb: Coomassie Blue Brilantná modrá G 250

Najdôležitejším činidlom tejto metódy je bezpochyby farbivo používané na „označenie“ proteínov vo vzorke. Bradford navrhol svoju prácu, pretože toto farbivo existuje dvoma spôsobmi: jedna červená a jedna modrá. Červený tvar sa stane modrým tvarom, keď sa farbivo viaže na proteín, čím tvorí komplex.

Komplex modrého proteínu modrej má veľmi vysoký molárny extinkčný koeficient, čo vedie k väčšej citlivosti na kvantifikáciu koncentrácie proteínu v analyzovaných vzorkách.

Činidlá

Aj keď riešenie použité pre túto kvantifikačnú metódu sa vo všeobecnosti uvádza na trh v uzavretých nádobách, už pripravené -„Bradford Reactive“ -hlavnými použitými činidlami sú:

- Coomassie modrá Brilantná modrá G50 (0.01% w/v)

- Kyselina fosforečná (8.5 % w/v)

- Etanol (4.7% w/v)

Kvantifikácia proteínov Bradfordovou metódou (Zdroj: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, cez Wikimedia Commons)

Rovnako ako pri akejkoľvek metóde a protokole kvantifikácii proteínov spektrofotometrickými metódami je potrebné mať „štandardný“ alebo „štandardný“ proteín na vykonanie a kalibračná krivka určiť hodnoty absorbancie súvisiace s rôznymi koncentráciami proteínu; Všeobecne sa používa hovädzí sérový albumín.

Môže vám slúžiť: čokoládový agar

Metóda spočíva v miešaní určitých zväzkov vzoriek problém s určitými zväzkami Bradfordovho činidla; Počkajte pár minút na interakciu farbiva-proteín a zmena farby je zrejmá a následne zmeraná a zaznamenajte hodnoty absorbancie, aby sa vykonali následné výpočty.

Použitie/aplikácie

Bradfordova metóda je jednou z metód kvantifikácie alebo odhadu najpoužívanejšej koncentrácie proteínov na svete, najmä v dôsledku jej nízky jeho reprodukovateľnosť a minimálna interferencia, ktorú majú zložky reagencií použitých počas merania.

Táto metóda sa používa v stovkách rôznych vedeckých aplikácií na stanovenie proteínov v rôznych kontextoch: fyziologické, cytologické, imunologické, klinické, priemyselné (najmä v potravinárskom priemysle) atď.

Experimentálne je táto metóda veľmi užitočná pre:

• Monitorujte množstvo proteínu obsiahnutého v objemoch, ktoré sa progresívne získavajú z chromatografickej kolóny (v afinitných kolónach, výmene iónov, absorpcia, gélová filtrácia).a. Analyzujte frakcie protokolov na čistenie proteínov.
• Monitorujte množstvo proteínu, ktoré je naložené v géli na elektroforézu.
• Odhadnite množstvo proteínu získaných v nadmernom expresnom systéme.

Odkazy

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, P. R. (2001). Kvantifikácia obsahu proteínov pomocou metódy Bradford. V príručke techník ekofyziológie rastlín (str. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Rýchla a citlivá metóda na kvantifikáciu mikrogramových množstiev proteínu pomocou hlavnej väzby v deň proteínu. Analytical Biochemistry, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, C. L., Bauer, w., & Urbatsch, i. L. (2020). Bradfordský test na stanovenie koncentrácie proteínov. Protokoly Cold Spring Harbour, 2020 (4), PDB-PROT102269.
4. Sapan, c. Vložka., Lundblad, r. L., & Price, n. C. (1999). Kolorimetrické techniky testu proteínov. Biotechnology a Applied Biochemistry, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (Devätnásť deväťdesiat šiestich). Príručka proteínových protokolov (zv. Devätnásť deväťdesiat šesť). Springer Science & Business Media.