Technická rekombinantná DNA, aplikácie a základy

On Rekombinantná DNA (DNA alebo rDNA) je umelá molekula nukleových kyselín vytvorená v laboratóriu integráciou dvoch záujmových organizmov organizmu. Je tiež známa ako chimérická DNA, vďaka svojej hybridnej vlastnosti. Tento typ DNA nenájdeme v prírode.

Základná metodika na generovanie zahŕňa: a) výber bielej DNA a jej vloženie do iného fragmentu DNA (všeobecne bakteriálny plazmid); (b) Zavedenie tohto plazmidu do baktérie, c) výber baktérií prostredníctvom antibiotík a nakoniec (d) expresia génu.

Zdroj: Pixabay.com

Táto technika využíva enzýmovú hru, ktorá vám umožňuje kopírovať a prilepiť konkrétne fragmenty DNA do skúšky výskumného pracovníka.

Cieľom rekombinantnej technológie je vo väčšine prípadov expresia proteínu (známeho ako rekombinantný proteín) požadovaná molekulárnym biológom pre budúce skúmanie alebo na vytvorenie proteínu komerčnej a terapeutickej hodnoty - napríklad ľudský inzulín, napríklad ľudský inzulín, napríklad ľudský inzulín.

[TOC]

Základy techniky rekombinantnej DNA a jej použitie v genetickom inžinierstve

Centrálna dogma molekulárnej biológie

Všetky organické bytosti, o ktorých poznáme, zdieľajú niekoľko charakteristík. Jedným z nich je povaha genetického materiálu a spôsob, akým sa vyrábajú proteíny - proces známy ako centrálna „dogma“ molekulárnej biológie.

S výnimkou páru vírusov, všetky organizmy ukladajú genetické informácie v DNA (kyselina deoxyribonukleová), zhromaždené veľmi kompaktné a organizované v bunkovom jadre.

Pre génovú expresiu je molekula DNA transkribovaná na Messenger RNA a druhá sa prekladá do aminokyselinového jazyka, štrukturálnych blokov proteínov.

Čo je to rekombinantná DNA?

Medzi 70. a 80. rokmi začali molekulárne biológovia využívať procesy, ktoré sa prirodzene vyskytujú vo vnútri bunky a podarilo sa ich extrapolovať do laboratória.

Týmto spôsobom sa gén zvierat (napríklad stavca) mohol vložiť do segmentu DNA z baktérií; alebo DNA baktérie sa môže kombinovať s vírusovou DNA. Môžeme teda definovať rekombinantnú DNA ako molekulu zloženú z DNA z dvoch rôznych organizmov.

Po vytvorení tejto hybridnej alebo rekombinantnej molekuly pokračujeme v expresii záujmového génu. So slovom prejav Chceme odvolať na proces translácie proteínu.

Môže vám slúžiť: monohíbrid

Reštrikcie a ligy enzýmy: kľúč k procesu

Kľúčovým prvkom na vývoj rekombinantnej technológie DNA bol objav reštrikčných enzýmov.

Jedná sa o proteínové molekuly, ktoré vykazujú schopnosť rozdeliť sa na DNA (nukleas) v betónových sekvenciách, ktoré slúžia ako „molekulárne nožnice“. Fragmenty generované týmito enzýmami sa nazývajú reštrikčné fragmenty.

Tieto enzýmy sa môžu produkovať v bielych sekvenčných symetrických rezu (v oboch reťazcoch v rovnakej výške) alebo asymetrických rezov. Kľúčovým aspektom pôsobenia reštrikčných enzýmov je to, že po rozdelení reťazí sa získa „voľná hrana“, doplní sa k druhému okraju, ktorý sa strihá rovnakým enzýmom.

Niektoré príklady sú ECOR 1 a SMA 1. V súčasnosti je známych viac ako 200 typov reštrikčných enzýmov a sú komerčne dostupné.

Aby boli užitočné, nožnice musia byť sprevádzané lepidlom. Tento účinok na tesnenie DNA (predtým ošetrený reštrikčnými enzýmami) sa vykonáva ligami.

Technika: Ako je DNA organizmu v laboratóriu umelo modifikovaná?

Ďalej popíšeme hlavné kroky požadované rekombinantnou technológiou DNA. Všetky sú vykonávané odborníkmi v laboratóriu molekulárnej biológie.

Čo je „klon“?

Pred pokračovaním v experimentálnom protokole si musíme všimnúť, že v molekulárnej biológii a biotechnológii sa všeobecne používa pojem „klon“ a sloveso „klonar“. To by mohlo viesť k zmätku.

V tejto súvislosti sa nevzťahujeme na klonovanie všetko organizmus (napríklad v prípade slávnych oviec Dolly), ale k klonovaniu fragmentu DNA, ktorý môže byť gén. To znamená, že produkuje veľa kópií - geneticky identických - sekvencie.

1. Izolácia a získanie DNA

Prvým krokom je rozhodnúť sa, ktorá sekvencia sa chce použiť. To úplne závisí od výskumného pracovníka a ciele jeho práce. Potom musí byť táto DNA izolovaná a čistená. Metódy a postupy na dosiahnutie tohto cieľa závisia od organizmu a tkaniva.

Časť tkaniva sa všeobecne prijíma a podlieha liečbe v lýze buff. Následne prebieha fragmentácia genetického materiálu v malých fragmentoch.

2. Klonovací vektor

Po prípravných krokoch sa výskumný pracovník snaží zaviesť segment DNA, ktorý je predmetom záujmu o klonovací vektor. Odteraz do tohto segmentu DNA to budeme nazývať biela DNA.

Môže vám slúžiť: dominantný gén: genetické princípy, metódy štúdia, faktory

Plazmidy

Jeden z najpoužívanejších vektorov v plazmide bakteriálneho pôvodu. Plazmid je dvojitá kruhová molekula DNA, ktorú nachádzame prirodzene v baktériách. Sú to entity mimo bakteriálneho chromozómu - to znamená, že sú extramozomálne a v týchto prokaryotoch sa prirodzene nachádzajú.

Základné prvky vektora sú: a) pôvod replikácie, ktorý umožňuje syntézu DNA; b) selekčná činidlo, ktorá umožňuje identifikáciu organizmov, ktoré nesú plazmid s bielym DNA, ako je napríklad rezistencia na antibiotikum; a (c) miesto multiklonácie, kde sa nachádzajú sekvencie, ktoré budú rozpoznávané reštrikčnými enzýmami.

Prvá úspešná rekombinantná DNA v laboratóriu bola klonovaná v plazmide PSC101 z baktérií A. coli. Toto obsahuje reštrikčné miesto pre reštrikčný enzým ECORI a rezistenčný gén na antibiotikum, okrem pôvodu replikácie.

Vloženie bielej DNA do plazmidu sa vykonáva pomocou molekulárnych nástrojov reštrikčných enzýmov a lig opísaných v predchádzajúcej časti.

Podstatné typy vektorov

Okrem plazmidov môže byť DNA vložená do iného vektora, ako je napríklad lambda bakteriofág.

3. Zavedenie rekombinantnej DNA

Akonáhle bola získaná rekombinantná molekula DNA (gén záujmu o plazmid alebo iný vektor).

Na zavedenie cudzieho DNA v baktérii sa používa technika nazývaná bakteriálna transformácia, kde sa telo predkladá na ošetrenie dvojmocnými katiónmi, vďaka ktorým je náchylná na užívanie DNA.

Metodicky nemôžeme zabezpečiť, aby 100% baktérií v našej plodine účinne vzalo našu rekombinantnú molekulu DNA. Tu prichádza do hry časť plazmidu, ktorá obsahuje rezistenciu na antibiotiká.

Baktérie, ktoré vzali plazmid, budú teda rezistentné na určité antibiotikum. Ak si ich vyberiete, bude stačiť na aplikáciu uvedeného antibiotikum a vezmite pozostalých.

4. „Zber“ proteín

Po výbere baktérií s našou rekombinantnou DNA pokračujeme v použití hostiteľského enzymatického mechanizmu na generovanie proteínového produktu, ktorý je predmetom záujmu. Keď sa reprodukujú baktérie, plazmid prechádza na jeho potomstvo, takže sa počas delenia nestratí.

Tento postup používa baktérie ako druh „továrne“ proteínu. Neskôr uvidíme, že to bol veľmi relevantný postup pri vývoji účinných lekárskych ošetrení.

Môže vám slúžiť: Telophase: Čo je v mitóze v meióze

Akonáhle je plodina pripravená a baktérie produkujú veľké množstvo proteínov, bunka alebo prasknutie bunky je. Existuje široká škála biochemických techník, ktoré umožňujú čistenie proteínu podľa ich fyzikálne-chemických charakteristík.

V inom experimentálnom kontexte nemusíme mať záujem o generovanie proteínu, ale máme záujem o získanie sekvencie DNA samy. Keby to tak bolo, plazmid by slúžil na vytvorenie viacerých kópií fragmentu, ktorý nás zaujíma s cieľom mať dostatočné množstvo bielej DNA na vykonanie príslušných experimentov.

Žiadosti

Rekombinantná technológia DNA otvorila nekonečné množstvo možností pre molekulárnu biológiu, biotechnológiu, medicínu a ďalšie súvisiace oblasti. Vaše najvýznamnejšie aplikácie sú nasledujúce.

Genetická analýza

Prvá aplikácia priamo súvisí s laboratóriami molekulárnej biológie. Rekombinantná technológia DNA umožňuje výskumným pracovníkom porozumieť normálnej funkcii génov a generované proteíny sa môžu použiť v následnom výskume.

Farmaceutický priemysel

Proteíny produkované pomocou rekombinantného postupu DNA majú aplikácie v medicíne. Dva veľmi relevantné príklady v teréne sú ľudský inzulín a rastový hormón, ktorý sa uplatňuje u pacientov bez takého proteínu.

Vďaka rekombinantnej DNA sa tieto proteíny môžu generovať bez potreby extrahovať z inej ľudskej bytosti, čo predstavuje ďalšie metodologické komplikácie a zdravotné riziká. To pomohlo zlepšiť kvalitu života nespočetných pacientov.

Odkazy

1. Baca, l. A. L., & Álvarez, C. L. C. (2015). Biológia 2. Redakčná skupina Patria.
2. Cooper, G. M., Hausman, r. A., & Hausman, R. A. (2000). Bunka: Molekulárny prístup k prístupu (Zv. 10). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, T. M. (2004). Biochémia: učebnica s klinickými aplikáciami. Obrátil som sa.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, r., Nabi, G., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Úloha rekombinantnej technológie DNA na zlepšenie života. International Journal of Genomics, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. P., & Mindan, P. (Devätnásť deväťdesiat šiestich). Patologická anatómia. Elsevier Španielsko.
6. Tortora, G. J., Funke, b. R., & Case, c. L. (2007). Úvod do mikrobiológie. Edimatizovať. Pan -American Medical.
7. The, M. J. (1989). Ľudský inzulín: prvý liek DNA technológie. American Journal of Health-System Pharmacy, 46(11_suppl), S9-S11.